双缩脲试剂由NaOH溶液（0.1g/mL）和CuSO₄溶液（0.01g/mL）配制而成，配制比例为5：1。但是双缩脲试剂不用现配现用，先加入NaoH营造碱性环境，再加入CuSO₄。
双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。且使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1～10mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约0.5mg以上。
双缩脲法的缺点是精确度低、所需样品量大。干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液，如TrIs缓冲液，因为它们产生阳性呈色反应，铜离子也容易被还原，有时出现红色沉淀。
扩展资料
双缩脲法
1、实验原理
双缩脲（NH₂CONHCONH₂）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的宏悉产物。在强碱性溶液中，双缩脲与二价铜离子形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫桐派色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。干扰这一局绝贺测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差，不适合微量蛋白的测定。
2、试剂与器材
试剂：
标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。
如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H₂O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05N NaOH配制。
双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC₄H4O₆·4H₂O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
器材：可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。
3、操作方法
标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。
用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。
样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。
参考资料来源：百度百科-双缩脲反应
参考资料来源：百度百科-双缩脲法
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